１．帶有非互補突出端的片段
用兩種不同的限制酶進行消化可以產生帶有非互補突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數質粒載體均帶有由幾個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點。由于現有的多克隆位點如此多樣，因而幾乎總是能找到一種帶有與外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位點的載體。于是，采用所謂的定向克隆即可將外源ＤＮＡ片段插入到載體當中。例如：載體pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ進行消化，然后，通過凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段，以使同芤下來的多克隆位點 缺小片段分開。于是，這一載體就可以同有與BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ區段相連接。用得到的環狀重級體化大腸桿菌，檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補，載體片段不能有效地環化，所以轉化大腸桿菌的效率也極低。因此，大多數具有氨芐表霉素抗性的細菌都含有帶外源ＤＮＡ區段的質業，外源ＤＮＡ區段成為連接HindⅢ和BamHI位點的橋梁。當然，可以根據特定的外源ＤＮＡ區段來改變限制酶的組合方式。 如要制備定向克隆載體，它盡量避免使用大多克隆位點上彼此直接相鄰的限制酶切位點。這些位點中的一個被切開以后，第二個位點應位于線狀ＤＮＡ分子一端的幾個堿基對之內，這樣過于靠近末端，不利于多種限制酶的有效切割。正因為如此，所以務必檢查兩種限制酶對載體的消化是否完全。可采用以下兩種檢查方法： １）用兩種限制酶中的一種對載體進行消化，當所用限制酶的最撻緩沖液對離子強度的要求有不同時，應使用所要求的鹽濃度較低的酶。消化完后，應通過凝膠電泳對一小份ＤＮＡ進行檢查。如所有質粒ＤＮＡ均從環狀轉變為線狀分子時，適當調整鹽濃度，并加入第二種酶。同時，另行設立一個預實驗，其中含有環狀質粒ＤＮＡ，并只加兩種限制酶中的第二種。當預實驗中的所有ＤＮＡ都轉變為線狀（由凝膠電泳確定）時，通過凝膠電泳或尺墳排阻凝膠層析純化質粒ＤＮＡ大片段。\par ２）圖1.7所示的是檢查消化反應完全程度的一種更為嚴格的方法。對用第一個限制酶切割的一小份ＤＮＡ進行末端標記，經離盡柱層析法純化后，與未標記的線狀ＤＮＡ混合。然后用第二個酶消化，完全消化可使ＤＮＡ小片段釋放，它應帶有50％的放射性活度，這可通過層析或通過凝膠電泳和放射自顯影加以檢測。
２。帶有相同末端（平端或粘端）的片段
帶有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質粒載體中。在連接反應中，外源ＤＮＡ和質粒都可能發生環化，也有可能形成串聯寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個ＤＮＡ的濃度，以便使“正確”連接產物的數量達到最佳水平（見本節三）．此外，常常使用堿性磷酸酶去除5'磷酸基團以抑制質粒ＤＮＡ的自身連接和環化。在體外連接反應中，僅當一個核苷酸含5'磷酸基團而另一個含3'羥基時，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶可催化相鄰核苷間形成磷酸二酯健。用細菌堿性磷酸酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線狀ＤＮＡ兩端的5'磷酸可以最大限度的地減少質粒ＤＮＡ區段可有效地與去磷酸化質粒ＤＮＡ相連接，產生一個含有兩個切口的開環分子（圖1.8）。因為環狀ＤＮＡ（即使是帶切口的環狀ＤＮＡ）的轉化效率比線狀ＤＮＡ高得多，所以大多數轉化體都含有重組質粒。
３．帶有平端的片段
外源ＤＮＡ片段帶平端時，還有一樁切外生枝的麻煩事，這就是蛺端的連接效率比起帶有突出互襪末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應所要求的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的濃度和外源及質粒ＤＮＡ的濃度都要高得多。還要說明的是，加入低濃度的如聚乙二醇一類的物質，常可提高這類反應的效率。