指高能化合物的放能水解作用或與基團(tuán)轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)的ATP合成作用。不包括光合磷酸化或呼吸鏈中氧化磷酸化的ATP生成過(guò)程。例如：糖酵解途徑中產(chǎn)生的高能磷酸化合物甘油酸-1，3-二磷酸和烯醇式磷酸丙酮酸在酶的作用下，高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ADP分子上生成ATP。又如三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的高能硫酯化合物琥珀酰輔酶A在酶的作用下水解成琥珀酸，同時(shí)使GDP磷酸化為GTP，GTP再與ADP作用生成ATP。這些都是底物水平磷酸化的實(shí)例。底物水平磷酸化沒(méi)有共同的作用機(jī)制。