（一）實驗目的：學習細菌的莢膜染色法：

（二）實驗原理：由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染莢膜，即設法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。

（三）實驗器材

1.活材料：培養3-5天的膠質芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus，俗稱“鉀細菌”）。該菌在甘露醇作碳源的培養基上生長時，莢膜豐厚。

2.染色液和試劑 ：Tyler法染色液：（見附二、（一）、14）、用濾紙過濾后的繪圖墨水、復紅染色液（見附二、（一）、2）、黑素（見附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO₄水溶液、香柏油、二甲苯。

3.器材： 載玻片、玻片擱架， 擦鏡紙、顯微鏡等。

（四）實驗方法

推薦以下四種染色法，其中以濕墨水方法較簡便，并且適用于各種有莢膜的細菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。

1.負染色法：

（1）制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻并涂布。

（2）干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。

（3）染色：在涂面上加復紅染色液染色2—3min。

（4）水洗：用水洗去復紅染液。

（5）干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。

（6）涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風干。

（7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。

結果：背影灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。

2.濕墨水法

（1）制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻。

（2）加蓋玻片 放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。

（3）鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。

結果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現一明亮的透明圈即為莢膜。

3.干墨水法

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑少量膠質芽胞桿菌與其充分混合，再加1環墨水，充分混勻。

（2）制片：左手執玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。

（3）干燥：空氣中自然干燥。

（4）固定：用甲醇浸沒涂片，固定1 min，立即傾去甲醇。

（5）干燥：在酒精燈上方，用文火干燥。

（6）染色：用甲基紫染1—2min。

（7）水洗：用自來水輕洗，自然干燥。

（8）鏡檢：先用低倍鏡再高倍鏡觀察。

結果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。

4.Tyler法

（1）涂片：按常規法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大。

（2）干燥：在空氣中自然干燥。

（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。

（4）脫色：用20%CuSO₄水溶液洗去結晶紫，脫色要適度（沖洗2遍）。用吸水紙吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片處，以防止CuSO₄結晶的形成。

（5）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。

結果：背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。

（五）實驗作業：

繪出Bacillus mucilaginosus的形態圖，并注明各部位的名稱

（六）注意事項

1.加蓋玻片時不可有氣泡，否則會影響觀察。

2.應用干墨水法時，涂片要放在火焰較高處并用文火干燥，不可使玻片發熱。

3.在采用Tyler法染色時，標本經染色后不可用水洗，必須用20%CuSO₄沖洗。