一、實驗目的

了解稀釋平板計數的原理，掌握涂抹平板培養法和混合平板培養法，認識細菌、放線菌、霉菌的菌落特征。

二、實驗原理

    稀釋平板計數是根據微生物在固體培養基上所形成的單個菌落，即是由一個單細胞繁殖而成這一培養特征設計的計數方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數時，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使成單個細胞存在（否則一個菌落就不只是代表一個細胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養基內。經培養后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。此法所計算的菌數是培養基上長出來的菌落數，故又稱活菌計數。一般用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑等）、生物制品檢驗、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。

三、實驗器材   

    1．活材料：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。

2．培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（附錄三、1）

3．器材：90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。

四、實驗方法

    1．樣品稀釋液的制備  準確稱取待測樣品l0g，放入裝有90ml無菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20 min，使微生物細胞分散，靜置20-30s，即成10^-1稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取10^-1稀釋液lml，移入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10^-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10^-2稀釋液1 ml，移入裝有9ml無菌水的試管中，也吹吸三次，即成l0^-3稀釋液；以此類推，連續稀釋，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀釋菌液（圖22-1）。

圖22-1  平板計數法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養

用稀釋平板計數時，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時，采用10^-7、10^-8、10^-9稀釋度，測定土壤細菌數量時，采用10^-4、10^-5、10^-6稀釋度，測定放線菌數量時，采用l0^-3、10^-4、10^-5稀釋度，測定真菌數量時，采用10^-2、10^-3、10^-4稀釋度。

2．平板接種培養  平板接種培養有混合平板培養法和涂抹平板培養法兩種方法。

    （1）混合平板培養法  將無菌平板編上10^-7、10^-8、10^-9號碼，每一號碼設置三個重復，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10^-9稀釋液各1ml放入編號10^-9的3個平板中，同法吸取10^-8稀釋液各lml放入編號10^-8的3個平板中，再吸取10^-7稀釋液各lml放入編號10^-7的3個平板中（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。然后在9個平板中分別倒入已融化并冷卻至45—50℃的細菌培養基(圖22-2)，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養。至長出菌落后即可計數。

（2）涂抹平板計數法  涂抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設三個重復）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，保溫培養，至長出菌落后即可計數。

五、實驗作業：

  將實驗結果填入下表中

計算結果時，常按下列標準從接種后的3個稀釋度中選擇一個合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數。

    （1）同一稀釋度各個重復的菌數相差不太懸殊。

    （2）細菌、放線菌、酵母菌以每皿30—300個菌落為宜，霉菌以每皿10—100個菌落為宜。

選擇好計數的稀釋度后，即可統計在平板上長出的菌落數，統計結果按下式計算。

混合平板計數法：

每克樣品的菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×稀釋倍數

涂抹平板計效法：

    每克樣品的菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×10×稀釋倍數