姐妹染色單體差別染色

姐妹染色單體區分染色法(Sister chromatid differentiation，SCD）是70年代中期發展起來的染色體處理技術。Latt（1973）在培養的細胞中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），當用Hoechst33258 熒光染料染色時，發現了姊妹染色單體的色差反映和它們之間互換的現象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改進了這一技術，建立了較簡易的BrdU-Giemsa技術。這種技術用于研究細胞周期、染色體半保留復制、染色體的分子結構和畸變，以及DNA的復制、損傷與修復等一系列重要理論問題，還可以用于分析姊妹染色單體互換（Sister chromatid exchange, SCE）頻率。由于SCE能靈敏地檢測染色體的變化，表現出劑量-效應關系。因此，目前已把SCE列為檢測致突變物、致癌物地常規指標之一。
一、原理
5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy-urdine, BrdU）在DNA的復制過程中，摻入新合成的鏈并占有胸腺嘧啶（thymidine, T）的位置。根據DNA的半保留復制規律，哺乳動物或人的細胞在BrdU的培養液中經歷了兩個周期后，它的兩條姊妹染色單體的DNA雙鏈在化學組成上有了差別。當染色體的DNA鏈的兩條多核苷酸鏈都被BrdU所替換，Giemsa染色顯示淺色，如果染色體的DNA鏈中僅有一條多核苷酸鏈被BrdU所替換，Giemsa染色顯示深色。應用姊妹染色單體區分染色法（SCD）研究來自一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發生同源片段的交換，稱為姊妹染色單體互換。
二、用品和試劑
45℃水浴，紫外線燈（20W）。余同外周血染色體制備。
試劑： BrdU溶液：用無菌青霉素瓶，在普通條件下稱取BrdU 2mg，然后在無菌室內加入無菌生理鹽水4ml，用黑紙避光，4℃冰箱保存，新鮮配置。1×SSC溶液：0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 檸檬酸鈉。
三、操作步驟
l．細胞培養：常規培養人外周血淋巴細胞，24h后，加入BrdU使其終濃度為20μg/ml。
2．繼續避光培養48小時，終止培養前2—3小時加秋水仙堿。
3．培養結束收獲細胞，常規制備染色體，操作同實驗一。
4．染色體制片在37℃恒溫箱內老化24小時或室溫放置1—2天。
5．將染色體制片的玻片正面向上平鋪在恒溫（45℃）水浴鍋上，在玻片上滴加已預熱至45℃的1×SSC溶液。
6．將紫外燈放在恒溫水浴上，燈與標本垂直，其外加蓋報紙數張以阻擋紫外線。照射距離為6cm，時間15min。
7．照射完畢后以蒸餾水洗去1×SSC。
8．1∶10 Giemsa染色5分鐘。
9．自來水細流沖洗去多余染料，干燥，鏡檢。
10．計數SCE。選擇染色體分散較好，數目為46的中期分裂相20個進行觀察計數，凡在染色單體端部出現的互換計為一次SCE，在染色單體中間出現的互換計為兩次SCE。凡在著絲粒部位發生一次互換，判斷不是兩條染色單體在著絲粒部發生的扭轉，計為一次SCE，但另列入“著絲粒區互換（CME）”一項。