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GB 4789.40-2024《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾檢驗》為上述標準之一。標準于2024年2月8日發布，將于2024年8月8日正式實施。
本文通過對比克羅諾桿菌檢驗2024版與2016版標準，使讀者更好地了解2024版修訂的變更，以便更好地掌握克羅諾檢驗的發展方向。
一、簡要說明
本標準與GB4789.40-2016相比主要變化如下：
--修改了標準名稱，刪除了阪崎腸桿菌，修改為“食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌檢驗”。
--標準適用范圍增加了嬰幼兒輔助食品;
--增加了PCR鑒定方法作為選做內容;
--刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產黃色素和苦杏仁苷項目;
--修改了培養基和試劑pH調節方法;
--修改了預熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養溫度和時間;
--修改了生化反應的培養溫度及氨基酸培養基的制備。
二、變化詳情
本標準規定了食品中克羅諾桿菌(Cronobacterspp)的檢驗方法。
本標準適用于嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗。
增加嬰幼兒輔助食品
2016版
2024版
1.刪除25度恒溫培養箱；恒溫水浴溫度范圍調整，由原來的44℃±0.5℃調整為41.5℃±1℃；
2.增加0.01感量的天平；無菌錐形瓶修改為無菌容器；
3.增加PCR檢測方法的所用到的PCR儀、離心機、電泳儀、反應管、離心管、接種環等設備和材料。
2024版
2016版
1.阪崎腸桿菌顯色培養基變更為“克羅諾桿菌顯色培養基”與標準名稱對應；
2.增加PCR檢測方法的培養基和試劑
2016版
2024版
1.ST-Vm增菌液培養溫度變更為“41.5℃±1℃”；
2.修改了預熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養溫度和時間
3.增加PCR鑒定（選做），可節省檢測時間
5.1 前增菌和選擇性增菌
取檢樣 100g(mL)置于無菌容器中,加入900mL已預熱至 41℃±1℃的 BPW,用手緩緩地搖動至檢樣充分溶解后,36℃±1℃培養18h±2h。輕輕搖動混勻培養過的前增菌液,移取1mL轉入10mLmLST-Vm肉湯中,41.5℃±1℃培養 24h±2h。
1.無菌錐形瓶改為“無菌容器”；
2.為避免溫度較高損傷細菌，前增菌BPW的預熱溫度由44℃修改為41 ℃。
3.44℃的選擇性增菌溫度可能抑制部分損傷的克羅諾桿菌生長，容易導致污染樣品被漏檢。ISO22964-2017標準已對選擇性增菌溫度由 44 ℃±0.5 ℃修改為41.5 ℃±1 ℃。且在制定標準過程中的驗證試驗結果也顯示，mLST-Vm肉湯經41.5 ℃培養后檢測結果優于44 ℃。因此，GB4789.40新版標準中選擇性增菌溫度修改為41.5 ℃±1 ℃。
5.2 分離
5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養物,使用10μL接種環各取1環增菌培養物,分別劃線接種于2個克羅諾桿菌顯色培養基平板,36℃±1℃培養24h±2h,或按培養基要求條件培養。
5.2.2 可疑菌落按顯色培養基要求進行判定,每個平板挑取至少 5個可疑菌落(不足5個時挑取全部可疑菌落) ,分別劃線接種于TSA平板,36℃±1℃培養 24h±2h。
1.分離用的接種環指出其為10μL的，更明確；
2.顯色培養基的名稱前后對應起來，刪除了“顯色培養基須符合GB4789.28的要求”，個人覺得這是個漏點。
3.修改了TSA平板的培養溫度和時間，由原來的25℃±1℃，培養48h±4h修改為“36℃±1℃培養 24h±2h”。
3.增加PCR鑒定方法：隨著微生物檢驗對快速方法的檢測需求， GB標準中引入PCR法，即可節省檢測時間，減少工作量，又可以提高結果的準確性，實現對可疑菌落高通量的篩選。
5.4 確證試驗
選做5.3時,自PCR結果陽性的TSA平板上挑取菌落進行生化鑒定, PCR結果陰性的TSA平板不再進行生化鑒定。
未選做 5.3時 ,直接將 5.2.2的可疑菌落接種TSA平板后進行生化鑒定。
可以首先鑒定克羅諾桿菌顯色培養基平板上最具特征性的菌落接種的TSA平板上的菌落。如果是陽性,則不需要測試其他TSA平板上的菌落。如果是陰性,則選取其他TSA平板上的菌落進行鑒定,直到全部為陰性或發現陽性菌落為止。為確保結果的準確性,對TSA平板上的菌落進行鑒定時,應使用新鮮的傳代菌落。克羅諾桿菌的主要生化特征見表3。
上述鑒定也可選擇商生化特征見表3。上述鑒定也可選擇商品化生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統進行 。
1.步驟名稱由鑒定修改為“確證試驗”；
2.刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產黃色素項目，因為在文獻報道和實際檢測中發現部分克羅諾桿菌不產黃色素，因此在新版標準中刪除了該步驟及生化鑒定中產黃色素項目的操作；
3.刪除苦杏仁苷生化反應；
4.強調做生化實驗的菌落一定要新鮮培養物，如果為陰性，需要繼續則選取其他TSA平板上的菌落進行鑒定,直到全部為陰性或發現陽性菌落為止。
6 結果與報告
根據菌落特征、確證試驗(生化鑒定)和/或PCR鑒定結果,報告 100g(mL)樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。
1.修改了文字描述；
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
取檢樣100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份,分別置無菌容器中,分別加入900mL、90mL、9mL已預熱至41℃±1℃的BPW,用手緩緩地搖動至檢樣充分溶解,制成1:10樣品勻液,36 ℃±1℃培養18h±2h。輕輕搖動混勻培養過的前增菌液,分別移入1mL轉入10mLmLST-Vm肉湯,41.5℃±1℃培養24h±2h。
1.修改了檢測方法的名稱；
2.同第一法一樣修改前增菌、增菌的培養溫度；
3.修改可了樣品處理的描述分固體和半固體、液體放在一起更簡潔。
7.2 分離、鑒定
同5.2、5.3和5.4。
8 結果與報告
綜合菌落特征、確證試驗(生化鑒定)或 PCR鑒定結果,根據檢出克羅諾桿菌的陽性管數,查MPN檢索表,報告100g(mL)樣品中克羅諾桿菌的MPN值(見附錄C中表 C.1) 。
1.修改了培養基和試劑pH值調節方法，要求pH值滅菌后測定；
2.修改了相應的培養基名稱及增加PCR檢測用的試劑配制方法。
3.修改了氨基酸培養基的制備。
