一、簡介

本試劑盒是應(yīng)用ELISA研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點,操作時間僅需55分鐘，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。

二、試驗原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中卡那霉素的含量。

三、適用范圍

可定性、定量檢測動物組織（肌肉、肝臟等）卡那霉素的殘留量。

四、交叉反應(yīng)率

卡那霉素…………………………………………………100%

鏈霉素……………………………………………………〈1%

雙氫鏈霉素………………………………………………〈1%

新霉素……………………………………………………… 〈1%

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅均質(zhì)器

┅┅電熱恒溫水浴鍋

┅┅振蕩器

┅┅渦旋儀

┅┅離心機(jī)

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶：500ml

┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、50ml

┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、200ml～1000ml

多道 250ml

試劑

 

----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)

----氯化鈉(分析純)

----氫氧化鈉(分析純)

----二水合磷酸二氫鉀(分析純)

----氯化鉀(分析純)

----去離子水

六、提供的材料與試劑

1、 96孔酶標(biāo)板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb

3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 1ppm

4、酶標(biāo)二抗       7ml ……………………………… 紅色帽

5、抗體工作液     10ml ………………………………綠色帽

6、底物液 A液   7ml ………………………………白色帽

7、底物液 B液    7ml ………………………………紅色帽

8、終止液         7ml ……………………………… 黃色帽

9、 20×濃縮洗滌液 40ml …………………………… 透明帽

10、2×濃縮復(fù)溶液   50ml ………………………………藍(lán)色帽

七、溶液的配制

配液1: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)

            稱取13.4g十二水合磷酸氫二鈉.20g氯化鈉.0.32g氫氧化鈉.0.5g二水合磷酸二氫鉀.0.5g氯化鉀加去離子水溶解定溶至500ml。

配液2: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液3: 復(fù)溶工作液

用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比進(jìn)行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水），用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

八、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（c）未處理的樣本冷凍保存。

（d）處理好的樣本保存不可超過12h，應(yīng)及時用于分析檢測。

雞肉＼豬肉、雞肝＼豬肝樣本前處理方法

----稱取2.0±0.05g去除脂肪的粉碎樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入6ml 0.1M PBS (PH=10~11)緩沖液（見配液1），混勻10min；

----放入60℃水浴環(huán)境中60min，取出水浴冷卻至室溫并搖勻；

----3000g以上，室溫離心10min；

----移取上清液，加入復(fù)溶工作液（見配液3），以1：4的體積比進(jìn)行稀釋（100ml上清液+400 ml復(fù)溶工作液）；

----取50ml用于分析。

九、檢測步驟

測定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml 到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)二抗50ml/孔，再加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)40min。

6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液2）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min（請參照注意事項8）。

8、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含卡那霉素成負(fù)相關(guān)。

1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.512，樣本2的吸光度值為0.899，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.950；0.5ppb為1.550；1.5ppb為1.200；4.5ppb為0.650；13.5ppb為0.301； 40.5ppb為0.110。則樣本1的濃度范圍是4.5ppb-13.5ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中卡那霉素殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中卡那霉素殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實際殘留量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

樣本的稀釋倍數(shù)：

肌肉、肝臟樣品的稀釋倍數(shù)：20

十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.5ppb

樣本最低檢測限：

雞肉/肝,豬肉/肝…………………………………………… 10ppb

準(zhǔn)確度：

雞肉/肝,豬肉/肝………………………………………… 90±15%

精密度：

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、儲存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。

9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。