PCR技術(shù)基本原理

發(fā)布日期：2025-02-28 來源：網(wǎng)絡(luò)

核心提示：（1）PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈

（1）PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA（待擴增DNA）、引物、4種脫氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性－－退火－－延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；②模板DNA與引物的低溫退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的適溫延伸：DNA模板－－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

（2）PCR的反應(yīng)動力學(xué)： PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴增量可用Y＝（1＋X）n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。

（3）PCR擴增產(chǎn)物：可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5＇端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3＇端開始延伸，其5＇端是固定的，3＇端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（即“長產(chǎn)物片段”）結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5＇端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3＇端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

編輯：songjiajie2010

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