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      提高RT-PCR反應體系的靈敏度方式解讀(二)

      放大字體  縮小字體 發布日期:2024-08-22  來源:上海撫生實業有限公司
      核心提示:3、提高逆轉錄保溫溫度較高的保溫溫度有助于RNA二結構的打開,增加了反應的產量。對于多數RNA模板,在沒有緩沖液或鹽的條件下,將


      3、提高逆轉錄保溫溫度

      較高的保溫溫度有助于RNA二結構的打開,增加了反應的產量。對于多數RNA模板,在沒有緩沖液或鹽的條件下,將RNA和引物在65℃保溫,然后迅速置于冰上冷卻,可以消除大多數二結構,從而使引物可以結合。

      4、促進逆轉錄的添加劑
      包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中,可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二結構,多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20%的甘油而不降低活性。

      5、RNaseH處理
      在PCR之使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板,在cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合,在這種情況下,RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時,RNaseH處理是必需的,比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板,RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應,RNaseH處理是可選的,因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA:DNA復合物中的RNA水解掉。

      編輯:songjiajie2010

       
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      關鍵詞: 體系
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