檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

照擴(kuò)增有信號(hào)排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng),造成交叉污染:

1、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；

2、引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度,并注意上下游引物的濃度配比；

3、鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度,或選擇更適合的mix試劑盒；

4、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增；

5、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染, 或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染, 建議對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行處理, 或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。  

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳R2<0.9,很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:

1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣誤差,使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度;

2、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融,將高濃度DNA模板分裝,保存于-20℃或-80℃,現(xiàn)配現(xiàn)用;

3、引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針;

4、模板中存在抑制物。模板濃度過高,根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求,一般模板量以50—500ng為宜。  

熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:

1、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn); 引物濃度不佳, 尤其是涉及二聚體存在時(shí), 適當(dāng)降低引物濃度, 并注意上下游引物的濃度比例;

2、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入, 或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增；

3、離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度, 或選擇更適合的mix試劑盒, 不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合, 有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果。

遇到擴(kuò)增曲線異常,比如“S”型曲線等等情況,有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:

1、模板的濃度太高或者降解;

2、熒光染料的降解;

3、在操作熒光定量PCR時(shí),帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等;

4、液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā),沒有很好的聚集在管子里;

5、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。 

該情況適用于針對(duì)所有的基因,特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴(kuò)增信號(hào)時(shí),應(yīng)考慮如下情況:

1、反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳,另外考慮熒光染料是否降解;

2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法,適當(dāng)延長(zhǎng)變性退火時(shí)間;

3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入的,應(yīng)先把模板適度稀釋,再加入反應(yīng)體系,減少抑制物的影響。