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異硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT與 十二烷基肌氨酸鈉 （Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄及構(gòu)建cDNA文庫，因此為大多數(shù)人采用。與氯化銫方法比較，雖然純度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但產(chǎn)量高完整性好，鹽易去除。
一、材料、試劑和儀器
1 材料 植物組織（根或葉）
2 試劑
1） 異硫氰酸胍溶液：4mol/L 異硫氰酸胍（GIT），25mmol/L檸檬酸鈉（pH 7.0）,0.5% 十二烷基肌氨酸鈉 （Sarcosyl）, 0.1M β－巰基乙醇 （用時(shí)再加，0.36mL/50mL體系）
2） 2mol/L NaAc （pH4.0）:用醋酸配，加少量水調(diào)pH。
3） 水飽和酚 （pH3.5）
4） 氯仿/異戊醇（CI）（24：1）
5） 異丙醇 ( －20℃存放)
6） DEPC－H2O （0.1%，V/V）
3 儀器 : 冰凍離心機(jī)，研缽
二、實(shí)驗(yàn)程序
1 大量提取
1） 取植物組織5g加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)到一支預(yù)冷50mL的離心管 中，順序加入：15mL 異硫氰酸胍溶液，1.5mL 2M NaAc（pH4.0）,15mL水飽和酚和3mL氯仿/異戊醇。混勻后置冰上15min。
2） 4℃，15 000g 離心30min轉(zhuǎn)上清于另一管中，加等體積異丙醇，混勻－20℃沉淀1hr.。
3） 4℃，15 000g 離心25min，棄去上清，加5mL 異硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加異丙醇—20℃沉 淀1hr。離心收集RNA沉淀，70％乙醇洗一次后晾干，加500μl DEPC處理的水溶RNA。取5μl電泳檢測完整性，取5μl測紫外吸收值檢測純度及濃度。
2 小量提取
1） 取2g左右植物組織放入研缽中，反復(fù)加入液氮充分研磨至粉末狀。加4－5mL異硫氰酸胍溶液。轉(zhuǎn)移到小離心管 中，每管0.5mL。
2） 置于冰上，順序加入：50μl 2mol/L NaAc , 混勻，0.5mL水飽和酚， 170μl CI，混勻。置冰上15min。
3） 各管平衡后，4℃,12 000g離心20-30min。轉(zhuǎn)移上清到另一管中，加入等體積的異丙醇，混勻，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12 000g離心20min回收RNA。
4） 用70％乙醇洗一次，4℃，12 000g離心5min。吸去乙醇，空氣中吹干RNA沉淀。用150μl 異硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。
5） 加等體積異丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12 000g離心20min回收RNA。
6） 用70％乙醇洗兩次后，吹干溶于適量的DEPC－H2 O中。部分分裝后進(jìn)行純度及完整性的檢測。其余加2.5倍體積乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。
7） 紫外分光光度分析純度和含量，甲醛變性瓊脂 糖凝膠電泳分析完整性。
